Mehrere ParA/MinD-ATPasen koordinieren die Positionierung unterschiedlicher Ladungen in einer Bakterienzelle

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3255 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In Eukaryoten steuern lineare Motorproteine ​​den intrazellulären Transport und die Organisation. In Bakterien, in denen an der räumlichen Regulierung beteiligte Linearmotoren fehlen, organisiert die ParA/MinD-Familie von ATPasen eine Reihe genetischer und proteinbasierter Zellladungen. Die Positionierung dieser Ladungen wurde in unterschiedlichem Ausmaß bei mehreren Bakterienarten unabhängig untersucht. Es bleibt jedoch unklar, wie mehrere ParA/MinD-ATPasen die Positionierung verschiedener Ladungen in derselben Zelle koordinieren können. Hier stellen wir fest, dass über ein Drittel der sequenzierten Bakteriengenome mehrere ParA/MinD-ATPasen kodieren. Wir identifizieren einen Organismus (Halothiobacillus neapolitanus) mit sieben ParA/MinD-ATPasen, zeigen, dass fünf davon jeweils für die räumliche Regulierung einer einzelnen zellulären Ladung zuständig sind, und definieren potenzielle Spezifitätsdeterminanten für jedes System. Darüber hinaus zeigen wir, wie sich diese Positionierungsreaktionen gegenseitig beeinflussen können, und betonen, wie wichtig es ist, zu verstehen, wie Organellentransport, Chromosomensegregation und Zellteilung in Bakterienzellen koordiniert werden. Zusammengenommen zeigen unsere Daten, wie mehrere ParA/MinD-ATPasen koexistieren und funktionieren, um eine Vielzahl grundlegender Ladungen in derselben Bakterienzelle zu positionieren.

Aktinfilamente, Mikrotubuli und die an ihnen entlanglaufenden linearen Motorproteine ​​sind für ihre räumliche Organisation in eukaryontischen Zellen bekannt. In Bakterien hingegen, in denen an der Positionierung beteiligte Linearmotoren fehlen, organisiert eine weit verbreitete Familie von ParA/MinD (A/D)-ATPasen Plasmide, Chromosomen und eine Reihe proteinbasierter Organellen räumlich, von denen viele für das Überleben der Zelle von grundlegender Bedeutung sind und Pathogenese. Die mit Abstand am besten untersuchten ATPasen und Namensgeber der Familie sind ParA, das an der Plasmidteilung und Chromosomentrennung1,2 beteiligt ist, und MinD, das an der Divisompositionierung3 beteiligt ist. Weniger untersucht ist die wachsende Liste von A/D-ATPasen, die in Prokaryoten weit verbreitet sind und an der räumlichen Regulierung verschiedener proteinbasierter Organellen wie bakteriellen Mikrokompartimenten (BMCs)4,5, Flagellen6,7, Chemotaxis-Clustern8,9 und Konjugationsmaschinen10 beteiligt sind.

Obwohl die Ladungen so unterschiedlich sind, haben A/D-ATPasen eine Reihe gemeinsamer Merkmale: (i) alle bilden ATP-Sandwich-Dimere11, (ii) die Dimerisierung bildet eine Schnittstelle zur Bindung einer Positionierungsmatrix – dem Nukleoid für ParA-ähnliche ATPasen12,13 oder die innere Membran für MinD-ähnliche ATPasen14,15 und (iii) die Dimerisierung bildet auch eine Bindungsstelle für ein verwandtes Partnerprotein, das eine ATPase mit ihrer Ladung verbindet und ihre Freisetzung aus der Positionierungsmatrix stimuliert. Beispielsweise ist bei der Chromosomensegregation der ParA-Partner ParB, der auf eine zentromerähnliche Stelle namens parS geladen wird, um einen massiven Komplex auf dem Chromosom in der Nähe des Replikationsursprungs (OriC)2 zu bilden. Dieser ParB-parS-Komplex stimuliert lokal die ParA-ATPase-Aktivität und die Nukleoidfreisetzung, wodurch ParA-Gradienten auf dem Nukleoid erzeugt werden. Die Trennung der Schwesterchromosomen erfolgt, wenn der ParB-parS-Komplex nukleoidgebundene ParA-Gradienten in entgegengesetzte Richtungen verfolgt16. Daher verwenden Prokaryoten im Gegensatz zum mitotischen Spindelapparat, der bei der eukaryotischen Chromosomensegregation verwendet wird, eine grundlegend andere Art der räumlichen Organisation: A/D-ATPasen erzeugen Wellen auf biologischen Oberflächen, um ihre jeweiligen Ladungen zu positionieren.

Chromosomensegregation, Zellteilungspositionierung und Organellenhandelsreaktionen wurden in unterschiedlichem Ausmaß bei mehreren Prokaryoten unabhängig voneinander untersucht. Es bleibt jedoch unbekannt, wie viele A/D-ATPasen in einem einzelnen Bakterium kodiert werden können, um mehrere unterschiedliche Ladungen zu positionieren, oder wie Bakterien die Positionierung eines so unterschiedlichen Satzes grundlegender Ladungen in derselben Zelle räumlich und zeitlich koordinieren. Darüber hinaus bleiben die mechanistischen Variationen und Spezifitätsdeterminanten, die die Positionierung eines so vielfältigen Satzes zellulärer Fracht bestimmen, unklar. Dies liegt daran, dass A/D-basierte Positionierungsreaktionen typischerweise unabhängig voneinander und in Modellbakterien mit wenigen A/D-ATPasen untersucht werden.

Hier stellen wir fest, dass ein Drittel der sequenzierten Bakterien mehrere A/D-ATPasen kodieren. Unter diesen Bakterien identifizierten wir Halothiobacillus neapolitanus (im Folgenden H. neapolitanus) mit sieben mutmaßlichen A/D-ATPasen. Die Nachbarschaftsanalyse der A/D-ATPase-Gene in H. neapolitanus lässt mehrere mutmaßliche Ladungen vermuten. Wir nutzen Genetik und Zellbiologie, um fünf der A/D-ATPasen in H. neapolitanus ihren Ladungen zuzuordnen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass jede ATPase direkt der Positionierung und getreuen Vererbung eines bestimmten Frachttyps gewidmet ist. Die Handhabbarkeit und Anzahl der A/D-ATPasen machten H. neapolitanus zu einem wertvollen Werkzeug, um auch zu untersuchen, wie Bakterien die Prozesse der Chromosomensegregation und Zellteilung mit dem Organellenhandel koordinieren – eine gut untersuchte Frage bei eukaryotischen Zellen, die bei Prokaryoten unbeantwortet bleibt. Wir zeigen, wie die Löschung einer A/D-ATPase über Defekte in der DNA-Replikation, Chromosomensegregation und/oder Zellteilung indirekte Auswirkungen auf die Vererbung unterschiedlicher Ladungen haben kann, die von anderen A/D-ATPasen positioniert werden. Wir liefern auch Beweise dafür, dass die Positionierung der Flagellen die räumliche Regulierung von Chemotaxis-Clustern beeinflusst. Schließlich identifizieren wir mutmaßliche Sequenz- und Strukturdeterminanten, die jede A/D-ATPase eindeutig mit einer bestimmten Ladung verknüpfen und letztendlich die Koexistenz und Funktion dieser verwandten ATPasen in derselben Zelle ermöglichen. Gemeinsam untersucht unsere Studie mechanistische Gemeinsamkeiten und Variationen in der am weitesten verbreiteten ATPase-Familie, die bei der räumlichen Regulierung verschiedener zellulärer Frachten über Prokaryoten hinweg und alle innerhalb einer einzelnen Zelle verwendet wird.

Es ist unklar, wie viele ATPasen der ParA/MinD (A/D)-Familie in einem einzelnen Organismus kodiert sind. Um diese Frage zu beantworten, führten wir eine umfangreiche tBLASTn-Analyse durch, wobei wir als Abfrage eine Konsensproteinsequenz verwendeten, die aus gut untersuchten A/D-ATPasen generiert wurde (siehe Methoden). Wie bereits festgestellt17, haben wir herausgefunden, dass ~ 96 % der Bakterien aus der NCBI Reference Sequence (RefSeq)-Datenbank mindestens eine A/D-ATPase kodieren (Supplementary Data 1 und 2). Diese Treffer wurden nach Bakterienarten gruppiert, die dann nach der Anzahl der A/D-Treffer geordnet wurden. Aus dieser ersten Liste haben wir viele Bakteriengenome gefunden, die für 10 bis 20 A/D-ATPasen kodieren. Allerdings waren die Genome dieser Bakterien mit den meisten A/D-ATPasen auf mehreren Plasmiden und Chromosomen kodiert, von denen jedes sein eigenes ParA-basiertes DNA-Segregationssystem kodierte18. Bei dieser Studie haben wir uns speziell darauf konzentriert, zu verstehen, wie mehrere A/D-ATPasen koexistieren und die Positionierung unterschiedlicher Ladungen in derselben Zelle koordinieren. Daher haben wir unseren Datensatz weiter gefiltert, um Bakterien zu identifizieren, die für mehrere A/D-ATPasen, aber nur ein Chromosom und keine stabilen Plasmide kodieren (Ergänzungsdaten 1 und 2). Selbst nach Berücksichtigung von Bakterien, deren Genom auf mehreren genetischen Elementen kodiert ist, ergab unsere bioinformatische Analyse, dass mehr als ein Drittel der sequenzierten Bakterien mehrere A/D-ATPasen kodieren (Abb. 1a, Zusatzdaten 1 und 2).

a 96 % der sequenzierten Bakteriengenome kodieren mindestens eine A/D-ATPase und 35 % kodieren mehrere. Jeder Spike stellt eine Bakterienart dar und die Spike-Länge gibt die Anzahl der eindeutigen A/D-Treffer pro Bakterium an. b H. neapolitanus kodiert sieben mutmaßliche ParA/MinD-ähnliche Positionierungssysteme. Die Gennachbarschaftsanalyse impliziert die mutmaßlichen Ladungen, die mit jeder mutmaßlichen A/D-ATPase verbunden sind. c Das mehrfache Sequenz-Alignment jeder A/D-ATPase aus H. neapolitanus mit experimentell bestätigten Mitgliedern der ParA/MinD-Familie impliziert weiter die mutmaßlichen Ladungen, die durch Gennachbarschaftsanalyse identifiziert wurden. Jede der mutmaßlichen A/D-ATPasen in H. neapolitanus gruppiert sich mit Familienmitgliedern, die nachweislich die angegebenen zellulären Ladungen (orange) in anderen Bakterien positionieren.

Als nächstes wollten wir herausfinden, wie mehrere A/D-ATPasen in derselben Zelle koexistieren können, um unterschiedliche Ladungen zu positionieren. Um diese Frage zu beantworten, haben wir einen Organismus aus unserer Liste von Bakterien identifiziert, die für mehrere A/D-ATPasen kodieren (Ergänzungsdaten 1 und 2). Unter den oberen 1 % der Bakterien (die sechs oder mehr A/D-ATPasen kodieren) identifizierten wir mehrere Krankheitserreger, darunter Clostridien, Burkholderia, Mykobakterien, Vibrio, Pseudomonas und Xanthomonas-Arten. Wir haben auch den nicht pathogenen und experimentell beherrschbaren Organismus H. neapolitanus identifiziert – einen langsam wachsenden, schwefeloxidierenden Chemoautotrophen, der sieben mutmaßliche A/D-ATPasen auf einem Chromosom kodiert (Abb. 1b). Die räumliche Regulierung durch A/D-ATPasen wurde weitgehend an schnell wachsenden Modellbakterien untersucht. Wir haben uns bewusst für ein langsam wachsendes Bakterium entschieden (6 Stunden Verdopplungszeit), da die seltenen DNA-Segregations- und Zellteilungsereignisse größere Beobachtungsfenster und einen direkteren Einblick in die Dynamik des Organellenhandels ermöglichten. Die Handhabbarkeit, die langsame Wachstumsrate und die Fülle an A/D-ATPasen machten H. neapolitanus zu einer idealen Wahl für weitere Untersuchungen.

Um festzustellen, ob die A/D-ATPase-Treffer in H. neapolitanus tatsächlich räumliche Regulatoren waren, führten wir eine Gennachbarschaftsanalyse (GNA) durch, um mutmaßliche Ladungen zu identifizieren (Abb. 1b). GNA ermöglicht es uns, auf die Funktion zu schließen, da A/D-ATPase-Gene häufig in der Nähe von ladungsassoziierten Loci kodiert werden. Beispielsweise wird das Chromosomentrennungssystem ParABS typischerweise in der Nähe von OriC19 kodiert. Bemerkenswerterweise umfassen die mutmaßlichen Ladungen, die wir mit diesem Ansatz identifiziert haben, das Chromosom und alle bekannten proteinbasierten Ladungen der A/D-ATPase-Familie20,21. Während die räumliche Regulierung dieser unterschiedlichen Ladungen in vielen verschiedenen Modellbakterien individuell untersucht wurde, wurde ihre koordinierte Positionierung durch mehrere A/D-ATPasen noch nie gemeinsam in einem Organismus untersucht.

Als zweiten bioinformatischen Beweis, der jede A/D-ATPase mit einer bestimmten Ladung verknüpft, untersuchten wir die Erhaltung der A/D-ATPase-Gennachbarschaften mithilfe der FlaGs-Analyse (Flanking Genes)22. Die FlaGs-Analyse sagt funktionelle Assoziationen voraus, indem sie eine Liste von NCBI-Proteinakzessionen als Eingabe verwendet und nachbarschaftskodierte Proteine ​​in homologe Gruppen gruppiert. Homologe jeder A/D-ATPase in H. neapolitanus wurden mithilfe von BLASTp identifiziert und Top-Hits wurden als Eingabe für die FlaGs-Analyse verwendet (ergänzende Abbildung 1). Die Analyse zeigt eine starke Erhaltung der A/D-ATPase-Gennachbarschaften über mehrere Bakterienstämme hinweg, was die mutmaßlichen Ladungen weiter impliziert. Aufgrund der begrenzten Daten zu A/D-ATPasen im Zusammenhang mit der Konjugation10 oder dem Stickstoffstoffwechsel haben wir diese Treffer von der weiteren Untersuchung in dieser Studie ausgeschlossen.

Mit den verbleibenden fünf A/D-ATPasen führten wir ein Mehrfachsequenz-Alignment gegen Mitglieder der ParA/MinD-Familie durch, die zuvor zur Positionierung einer zellulären Ladung etabliert wurden (Abb. 1c). Jede A/D-ATPase in H. neapolitanus geclustert mit einem bestimmten Familienmitglied, von dem bekannt ist, dass es eine bestimmte zelluläre Ladung in anderen Bakterien positioniert – dem Chromosom (ParA2), dem Divisom (MinD23), dem Carboxysom (McdA4,5), dem Flagellum (FlhG6). ,7) und der Chemotaxis-Cluster (ParC8,9). Diese Daten liefern eine dritte Beweislinie, die die von unserer GNA identifizierten mutmaßlichen Ladungen weiter verdeutlicht. Als nächstes versuchten wir, die Rolle jeder A/D-ATPase bei der Positionierung der von der Bioinformatik betroffenen Ladungen direkt zu identifizieren.

Die Chromosomentrennung vor der Zellteilung ist entscheidend für das Überleben der Zelle. Bei den meisten Bakterien werden die getreue Chromosomentrennung und -vererbung durch ein ParAB-System vermittelt, das in der Nähe von OriC19 kodiert ist. Ohne ParAB wird die DNA asymmetrisch vererbt, was zu kernlosen und polyploiden Zellen sowie zu einer verminderten Zellfitness oder zum Tod führt2. In H. neapolitanus gibt es ein mutmaßliches parAB-System, das in der Nähe von OriC kodiert ist (Abb. 2a). Um die Chromosomensegregation abzubilden, wurde das ParB-Homolog, das stromabwärts des mutmaßlichen parA-Gens (Hn2335) kodiert, mit dem fluoreszierenden proteinmonomeren Neon Green (mNG) fusioniert. ParB-mNG wurde als ein oder zwei Puncta pro Zelle beobachtet (Abb. 2b). Die Populationsanalyse ergab, dass kürzere Zellen einen einzigen Fokus in der Zellmitte hatten, während längere Zellen zwei Fokusse an den Viertelpositionen der Zelle hatten (Abb. 2b). Als das mutmaßliche parA-Gen (Hn2335) gelöscht wurde, fehlten ParB-mNG-Herde in 25 % der Zellen vollständig (ergänzende Abbildung 2d). Wenn ParB-Herde vorhanden waren, wurden sie unabhängig von der Zelllänge zufällig positioniert (Abb. 2c) und waren im Vergleich zu WT-Zellen (Wildtyp) deutlich heller (ergänzende Abb. 2e). Durch die Komplementierung mit Hn2335 an einem exogenen Ort wurde die Fokuspositionierung wiederhergestellt (ergänzende Abbildung 2h). Diese Daten legen nahe, dass die replizierten Chromosomen in ∆Hn2335 nicht mehr genau getrennt waren, was zu kernlosen und polyploiden Zellen führte.

a–d Hn2335 ist für die Chromosomentrennung erforderlich. Ein Hn2335 wird in der Nähe von OriC gefunden und hat ein ParB-Homolog, das stromabwärts kodiert ist. b, c Die Ursprungsregion des Chromosoms wurde durch Markierung des ParB-Homologs markiert. Hellrot: 1 Fokus/Zelle; dunkelrot: 2 Herde/Zelle. Kurze WT-Zellen hatten einen einzigen Fokus in der Zellmitte, während längere Zellen zwei Fokusse an den Viertelpositionen hatten. ΔHn2335-Zellen zeigten unabhängig von der Zelllänge eine zufällige Positionierung der ParB-Foci. d Cartoon-Diagramme zeigen die Chromosomensegregation in WT- und ΔHn2335-Zellen. Für die Divisomenpositionierung ist e–h Hn1364 erforderlich. e Hn1364 befindet sich stromaufwärts von minE. f, g Die Positionierung der Divisome wurde durch die Lage der Verengungsstellen bestimmt. Jeder Punkt im Dichtediagramm stellt eine identifizierte Verengungsstelle dar. In WT-Zellen befanden sich Verengungsstellen in der Zellmitte. In ΔHn1364 wurden Verengungsstellen über die gesamte Zelllänge gefunden. h Cartoon-Diagramme zeigen die Zellteilung in WT- und ΔHn1364-Zellen. Die i–l-Carboxysomenpositionierung wird durch McdA bestimmt. i Hn0912 (mcdA) kommt in der Nähe von Genen vor, die für Carboxysomen-Schalenproteine ​​und Rubisco kodieren. j, k Carboxysome wurden durch Markierung der kleinen Untereinheit des Rubisco-Enzyms, cbbS, sichtbar gemacht. Jeder Punkt im Dichtediagramm repräsentiert einen Carboxysom-Fokus. In WT-Zellen sind Carboxysomen entlang der Zelllänge verteilt. In ΔmcdA bildeten Carboxysomen große Polherde an einem oder beiden Polen. l Cartoon-Diagramme zeigen die Carboxysomenverteilung in WT- und ΔHn0912-Zellen. m–p Hn0716 ist für die Regulierung der Flagellenposition und der Kopienzahl erforderlich. m Hn0716 wird in der Nähe von Flagellen-assoziierten Genen gefunden. n, o Die Flagellenlokalisation wurde durch Markierung einer Komponente des Flagellenbasalkörpers, fliN, sichtbar gemacht. Jeder Punkt im Dichtediagramm repräsentiert einen FliN-Fokus. WT-Zellen hatten einen einzelnen polaren FliN-Fokus. In ΔHn0716-Zellen waren FliN-Foci eher zufällig entlang der Zelllänge positioniert. p Cartoon-Diagramme zeigen die Lokalisierung und Anzahl der Flagellen in WT- und ΔHn0716-Zellen. q–t Hn0722 ist für die Positionierung des Chemotaxis-Clusters erforderlich. q Hn0722 wird in der Nähe von Chemotaxis-assoziierten Genen gefunden. r, s Chemotaxis-Cluster wurden durch Markierung des Reaktionsregulators cheY sichtbar gemacht. Jeder Punkt im Dichtediagramm repräsentiert einen CheY-Fokus. WT-Zellen hatten einen einzelnen CheY-Polarfokus. ΔHn0722-Mutantenzellen hatten typischerweise keine CheY-Herde. t Cartoon-Diagramme zeigen Chemotaxis-Cluster in WT- und ΔHn0722-Zellen. (Alle Bilder) Die gezeigten mikroskopischen Aufnahmen sind repräsentative Bilder von mindestens drei Experimenten. Maßstabsbalken: 2 μm. (Alle Grafiken) Zellen wurden mit MicrobeJ analysiert und quantifiziert. Auf der Y-Achse sind die Zellen nach zunehmender Zelllänge sortiert, wobei oben kürzere Zellen und unten längere Zellen stehen. Die x-Achse stellt den Abstand von der Zellmitte in Mikrometern dar; Die mittlere vertikale Linie entspricht einem Abstand von Null von der Zellmitte. Jeder Punkt stellt dar, wo entlang der Länge der Zelle ein Fokus gefunden wurde. Bei allen Dichtediagrammen stehen hellere Farben für eine höhere Dichte, dunklere Farben für eine geringere Dichte. Bei Flagellen-, Chemotaxis- und Carboxysomendiagrammen war der Zellpol, der einem Fokus am nächsten lag, nach links ausgerichtet; Brennpunkte in der rechten Hälfte des Diagramms weisen auf das Vorhandensein eines zweiten Brennpunkts hin. Diagrammachsen für Chromosome, Carboxysome, Flagellen und Chemotaxis-markierte Mutanten: Y-Achsenbereich (Zelllänge): 0,8–2,1 μm; x-Achsenbereich (Abstand von der Zellmitte): −1,1–1,1 μm. Die X-Achse von ΔflhG-Zellen beträgt 0,5–1,8 μm. Diagrammachsen für Divisom: Y-Achsenbereich (Zelllänge): 1,5–3,0 μm; x-Achsenbereich (Abstand von der Zellmitte): −1,5–1,5 μm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anschließend führten wir eine Zeitraffermikroskopie von ParB-mNG-Herden und SYTOX-gefärbten Nukleoiden durch, um die Chromosomensegregation in Echtzeit zu beobachten. Neugeborene WT-Zellen haben einen einzelnen ParB-Fokus in der Zellmitte, der sich dann in zwei Brennpunkte aufteilt, die sich bidirektional in Richtung der Viertelpositionen der wachsenden Zelle aufteilen (ergänzende Abbildung 2f und ergänzender Film 1A). Die Fokuspositionierung an den Zellvierteln wurde beibehalten, die dann nach der Teilung zur mittleren Zellposition jeder Tochterzelle wurde. Die getreue Chromosomentrennung und -vererbung ging verloren, als das mutmaßliche parA-Gen (Hn2335) gelöscht wurde (ergänzende Abbildung 2g und ergänzender Film 1B). Viele Zellen hatten einen einzigen großen ParB-Fokus an einem Zellpol, der sich nicht teilte, und die gesamte DNA wurde bei der Teilung in einer einzigen Tochterzelle konzentriert. Diese polyploiden Töchter teilten sich weiter, während die kernlosen Töchter nicht mehr lebensfähig waren. Diese Daten bestätigten, dass die erhöhten ParB-Foci-Intensitäten in der Deletionsmutante einen Anstieg der Chromosomenkopienzahl in diesen Zellen darstellen. Zusammenfassend ist die von Hn2335 kodierte A/D-ATPase für eine getreue Chromosomentrennung erforderlich (Abb. 2d) und wir werden dieses Protein im Folgenden als ParA bezeichnen.

Durch die richtige Positionierung des Divisoms wird sichergestellt, dass bei der Zellteilung beide Tochterzellen ungefähr gleich lang sind. Ohne das Min-System erfolgt die Teilung in jeder nukleoidfreien Region24 und es entstehen kernlose Minizellen, die Produkte polarer Teilungen. Unsere bioinformatischen Analysen zeigten, dass das von Hn1364 kodierte Protein ein MinD-Homolog ist und dass sich unmittelbar hinter diesem Gen im selben Operon ein Gen befindet, das ein MinE-Homolog kodiert (Abb. 2e). Um festzustellen, ob Hn1364 tatsächlich an der Divisomenpositionierung beteiligt war, analysierten wir sich teilende Zellen und identifizierten ihre Verengungsstellen im Verhältnis zur Zelllänge (Abb. 2f, g). WT-Zellen teilten sich nahe der Zellmitte (Abb. 2f und ergänzende Abb. 3d), während sich die ΔHn1364-Zellen asymmetrisch teilten (Abb. 2g und ergänzende Abb. 3e). Die Populationsanalyse sich teilender Zellen identifizierte Verengungsstellen in der Zellmitte in 97 % der WT-Zellen, verglichen mit nur 41 % der ΔHn1364-Zellen (ergänzende Abbildung 3f und ergänzender Film 2). Zusätzlich zu einzelnen asymmetrischen Teilungsereignissen bildeten 9% der sich teilenden Zellen in der ΔHn1364-Mutantenpopulation gleichzeitig mehrere Teilungsstellen entlang der Zelllänge (ergänzende Abbildung 3e, ergänzende Abbildung 3g und ergänzender Film 2C). Die ungleichen Teilungen führten zu einer größeren Variation der Zelllänge (ergänzende Abbildung 3h). Die Komplementierung mit Hn1364 an einem exogenen Ort stellte die Verengung in der Zellmitte und Einzelteilungsereignisse wieder her (ergänzende Abbildung 3j). Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass Hn1364 für die Positionierung des Divisoms in der Zellmitte von entscheidender Bedeutung ist (Abb. 2h) und wir werden dieses Protein künftig als MinD bezeichnen.

Bakterielle Mikrokompartimente oder BMCs sind große ikosaedrische Organellen auf Proteinbasis, die empfindliche Stoffwechselreaktionen einkapseln, um Prokaryoten deutliche Wachstumsvorteile zu verschaffen25. Trotz ihrer Bedeutung ist wenig darüber bekannt, wie BMCs räumlich reguliert werden. Das Modell-BMC ist das kohlenstofffixierende Carboxysom, das in Cyanobakterien und Proteobakterien vorkommt26. Kürzlich wurde festgestellt, dass eine A/D-ATPase, die wir „Maintenance of Carboxysome Distribution Protein A“ (McdA) nennen, unter Carboxysomen enthaltenden Bakterien, einschließlich H. neapolitanus, weit verbreitet ist (Abb. 2i)4. McdA platziert Carboxysomen zusammen mit seinem Partnerprotein McdB27,28 auf dem Nukleoid. Um die Notwendigkeit der Carboxysomenpositionierung zu demonstrieren, haben wir Carboxysomen visualisiert, indem wir die kleine Untereinheit des eingekapselten Rubisco-Enzyms (cbbS) mit mTurquoise2 markiert haben, um CbbS-mTQ zu bilden. Wie bereits gezeigt, sind Carboxysomen in WT-Zellen über die Zelllänge verteilt (Abb. 2j, ergänzende Abb. 4d). In der Deletionsmutante (ΔmcdA) bilden Carboxysomenaggregate einen großen hellen Polarfokus an einem oder gelegentlich an beiden Polen (Abb. 2k, ergänzende Abb. 4d, e). Die Komplementierung mit mcdAB an einem exogenen Ort stellte die Carboxysomenpositionierung wieder her (ergänzende Abbildung 4h). Diese Daten stimmen mit unseren früheren Beobachtungen mittels TEM überein, die zeigten, dass Herde in der Mutantenpopulation eine Ansammlung zusammengesetzter Carboxysomen darstellen 28 .

Wir erweitern hier unsere bisherigen Erkenntnisse mit der Langzeit-Zeitraffermikroskopie. In WT-Zellen werden Carboxysomen über mehrere Generationen hinweg dynamisch entlang der Zelllänge positioniert (ergänzende Abbildung 4f und ergänzender Film 3A). In der Deletionsmutante stagnierten die polaren Carboxysomenaggregate (ergänzende Abbildung 4g und ergänzender Film 3B). Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die im Carboxysom-Operon kodierte A/D-ATPase, die wir McdA nennen, für die Verteilung der Carboxysomen über die Zelllänge und die Sicherstellung der Organellenhomöostase nach der Teilung unerlässlich ist (Abb. 2l).

Flagellen sind äußere filamentöse Strukturen, die die Beweglichkeit von Bakterien ermöglichen. Bakterien variieren in Bezug auf Lage, Anzahl und Muster der Geißeln. Viele Bakterien kodieren in ihrem Flagellenoperon eine A/D-ATPase namens FlhG, die für verschiedene Flagellationsmuster in vielen Bakterien essentiell ist7, die Mechanismen bleiben jedoch unklar (ergänzende Diskussion). Bei polaren Flagellaten führt die Deletion von flhG typischerweise zu Veränderungen der Anzahl und Beweglichkeit der Flagellen6,29,30,31,32,33,34. Unterdessen führt die Deletion von flhG im peritrichen Organismus Bacillus subtilis zu Veränderungen der Flagellenposition35. Überraschenderweise führt die Deletion von flhG im amphitrichen Organismus Campylobacter jejuni auch zu Zellteilungsdefekten36,37.

Unsere bioinformatische Analyse legt nahe, dass Hn0716 innerhalb des Flagella-Operons ein FlhG-Homolog kodiert (siehe Abb. 1c). Um festzustellen, ob Hn0716 an der räumlichen Regulierung der Flagellen beteiligt ist, haben wir zunächst eine mNG-Fusion von FliN visualisiert, einem Bestandteil des Flagellenbasalkörpers, der sich an der zytoplasmatischen Seite der Membran ansammelt (Abb. 2m)38. WT-Zellen hatten einen einzelnen mNG-FliN-Fokus am äußersten Zellpol (Abb. 2n). In ΔHn0716-Zellen waren die FliN-Herde nicht mehr genau positioniert (Abb. 2o) und es war wahrscheinlicher, dass die Zellen keine oder mehrere Herde aufwiesen (ergänzende Abb. 5d). Die Komplementierung mit Hn0716 an einem exogenen Ort stellte die Lokalisierung der FliN-Fokus an den Polen wieder her (ergänzende Abbildung 5i). Diese Daten legen nahe, dass Hn0716 für die Positionierung eines einzelnen Flagellums an einem einzelnen Pol bei H. neapolitanus erforderlich ist.

Als nächstes wollten wir feststellen, ob diese Veränderungen der FliN-Positionierung die Zellmotilität beeinflussten. Motilitätstests in Weichagar ergaben, dass ΔHn0716-Zellen nicht beweglich waren (ergänzende Abbildung 5g). Der Verlust der Beweglichkeit kann auf eine Fehlstellung der Geißeln, einen Geißelverlust oder eine Hypergeißelung zurückzuführen sein. Um Flagellen abzubilden, haben wir FlagellinT185C entwickelt, das eine Fluoreszenzmarkierung von Flagellen durch Zugabe eines Cystein-reaktiven Maleimid-Färbers zum Medium ermöglicht39. Wir fanden heraus, dass WT H. neapolitanus-Zellen monotrich sind und ein einzelnes polares Flagellum vom FliN-Fokus ausgeht (Ergänzung. Abb. 5h). ΔHn0716-Zellen wiesen ebenfalls Flagellen auf, die von FliN-Herden ausgingen. Die Zellen waren jedoch hypergeißelt, wobei mehrere Flagellen oft zu Büscheln gebündelt waren und von mehreren FliN-Herden ausgingen. Wir kommen zu dem Schluss, dass Hn0716 für die Regulierung der Anzahl und Position der Flagellen in H. neapolitanus erforderlich ist (Abb. 2p) und werden dieses Protein künftig als FlhG bezeichnen. Zukünftige Studien werden die einzigartigen pleiotropen Wirkungen von flhG auf die Anordnung, Anzahl und Position der Flagellen sowie die Zellteilung bei H. neapolitanus untersuchen (ergänzende Diskussion).

Die Steuerung der Bakterienmotilität erfolgt über große sechseckige Anordnungen, sogenannte Chemotaxis-Cluster, die aus Chemorezeptoren, einem Adapterprotein (CheW) und einer Kinase (CheA) bestehen. Es wurden mehrere Mechanismen entwickelt, um sowohl die Anzahl als auch die Positionierung von Chemotaxis-Clustern zu steuern, einschließlich der Verwendung von A/D-ATPasen (bei Vibrio-Arten ParC oder bei R. sphaeroides PpfA genannt). Bei Vibrio-Arten lenkt ParC Chemotaxis-Arrays zu einem polaren Orientierungsprotein namens HubP8,40. Infolgedessen erben Tochterzellen bei der Zellteilung eine Anordnung an ihrem alten Pol. In R. sphaeroides gibt es keine polaren Orientierungspunkte und PpfA verteilt Chemotaxis-Cluster über das Nukleoid9,41. Wo untersucht, verändert die Deletion der A/D-ATPase die Anzahl und Positionierung der Chemotaxis-Cluster in den Zellen, was zu einer Verringerung der Ausbreitungsmotilität in Weichagar führt.

Unsere bioinformatische Analyse zeigte, dass das von Hn0722 kodierte Protein ein ParC/PpfA-Homolog innerhalb des Chemotaxis-Operons von H. neapolitanus ist (siehe Abb. 1c). Um festzustellen, ob Hn0722 für die räumliche Regulierung von Chemotaxis-Clustern wichtig ist, haben wir zunächst Chemotaxis-Cluster abgebildet, indem wir mNG mit CheY fusionierten (Abb. 2q). CheY ist ein Reaktionsregulator, der durch CheA phosphoryliert wird und von dem zuvor gezeigt wurde, dass er mit Chemotaxis-Clustern in E. coli kolokalisiert42,43. In Übereinstimmung mit elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Chemotaxis-Clustern in H. neapolitanus44 bildete CheY-mNG in ~ 85% der WT-Zellen einen einzelnen Fokus unmittelbar proximal zu einem Zellpol (Abb. 2r, ergänzende Abb. 6d). Als jedoch Hn0722 gelöscht wurde, war das CheY-mNG-Signal in ~ 80 % der Zellpopulation diffus (Abb. 2s, ergänzende Abb. 6d). In den ca. 20 % der ΔHn0722-Zellen, die einen CheY-mNG-Fokus aufwiesen, waren die Herde deutlich schwächer in der Intensität (ergänzende Abbildung 6e). Durch die Komplementierung mit den überlappenden Genen Hn0722 und Hn0723 wurden CheY-Herde an den Polen wiederhergestellt (ergänzende Abbildung 6f). Gemeinsam kommen wir zu dem Schluss, dass Hn0722 für den Aufbau und die Positionierung von Chemotaxis-Clustern in H. neapolitanus erforderlich ist (Abb. 2t), und wir werden dieses Protein künftig als ParC bezeichnen.

Bisher haben wir direkte Beweise dafür geliefert, dass fünf A/D-ATPasen fünf unterschiedliche Zellladungen in H. neapolitanus positionieren (Abb. 2). Als nächstes fragten wir, ob jede der fünf Positionierungsreaktionen unabhängig voneinander ablief. Um diese Frage zu beantworten, haben wir jede A/D-ATPase in jedem frachtmarkierten Hintergrundstamm einzeln gelöscht (Abb. 3). Wir fanden heraus, dass die Positionierung von Carboxysomen (Abb. 3c) und Flagellen (Abb. 3d) durch die Deletion entfernter A/D-ATPasen weitgehend unbeeinflusst blieb. Interessanterweise wurden die Positionierung oder Fokusintensität von Chromosomen (Abb. 3a), Divisomen (Abb. 3b) und Chemotaxis-Clustern (Abb. 3e) alle in ΔflhG-Zellen beeinflusst, wenn auch mit intermediären Phänotypen im Vergleich zur Löschung der dedizierten A/D-ATPase ( Abb. 3, fette Kästchen). Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass jede A/D-ATPase der Positionierung eines bestimmten Ladungstyps gewidmet ist und nicht direkt an der Positionierung anderer Ladungen beteiligt ist. Unsere Daten auf Zellpopulationsebene enthüllten jedoch auch mögliche Koordination, Übersprechen und/oder gegenseitige Abhängigkeiten zwischen bestimmten Positionierungsreaktionen. In den nächsten drei Abschnitten analysieren wir, wie die Ladungspositionierung durch eine A/D-ATPase indirekt mit der Positionierung und Vererbung einer Ladung, die durch eine andere A/D-ATPase positioniert wird, koordiniert werden kann.

Jede der fünf zellulären Ladungen wurde wie angegeben fluoreszierend markiert (links): a Chromosom (ParB-mNG), b Divisom (Invaginationsstelle), c Carboxysome (CbbS-mTQ), d Flagellen (mNG-FliN) und e Chemotaxis-Cluster (CheY-mNG). (Alle Bilder) Die gezeigten mikroskopischen Aufnahmen sind repräsentative Bilder von mindestens drei Experimenten. Maßstabsbalken: 2 μm. Die Spalte „Nur Etikett“ zeigt die WT-Positionierung jeder fluoreszierenden Ladung. Das Löschen einer A/D-ATPase führte nur zur Fehllokalisierung ihrer spezifischen Ladung (fettgedruckte Rechtecke). Die Diagramme in der Spalte „Nur beschriften“ und die Diagramme in den fettgedruckten Rechtecken sind aus Abb. 2 dupliziert. Diagrammachsen für Chromosome, Carboxysome, Flagellen und Chemotaxis-markierte Mutanten: X-Achsenbereich (Zelllänge): 0,8–2,1 μm; Y-Achsenbereich (Abstand von der Zellmitte): −1,1–1,1 μm. Alle x-Achsen von ΔflhG-Zellen betragen 0,5–1,8 μm. Diagrammachsen für Divisom: X-Achsenbereich (Zelllänge): 1,5–3,0 μm; Y-Achsenbereich (Abstand von der Zellmitte): −1,5–1,5 μm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir haben gezeigt, dass die Deletion von parA zu einem erheblichen Anteil an kernlosen Zellen führt, da ParA direkt für die Chromosomentrennung und Vererbung nach der Zellteilung erforderlich ist (Abb. 4a). Das Löschen von minD oder flhG führte ebenfalls zu kernlosen Zellen, der Mechanismus war jedoch in jedem Fall unterschiedlich. In ΔminD-Zellen waren die Chromosomenpositionierung (Abb. 4b) und die Intensität der ParB-Foci (Abb. 4c) denen von WT ähnlich, was zeigt, dass die Chromosomensegregation immer noch aktiv war. Stattdessen war es die Fehlpositionierung der Divisomen in ΔminD-Zellen und die anschließende asymmetrische Zellteilung (Abb. 4d), die indirekt zur asymmetrischen Chromosomenvererbung und zur Bildung von Kernzellen führte.

a Die Löschung der A/D-ATPase, die für die Positionierung von Chromosomen (parA), Divisomen (minD) oder Flagellen (flhG) erforderlich ist, führte zu kernlosen Zellen (graue Kästchen). b Nur ΔparA-Zellen hatten falsch positionierte ParB-Foci. Zellen mit einem einzelnen ParB-Fokus sind rot. Zellen mit zwei ParB-Foci sind schwarz. ΔflhG-Zellen behielten in langen Zellen einen einzelnen ParB-Fokus bei, was auf einen DNA-Replikationsdefekt schließen lässt. c ParB-Foci sind nur in ΔparA-Zellen heller. WT: n = 1289; ∆parA: n = 773; ∆minD: n = 990; ∆flhG: n = 747 biologisch unabhängige Zellen. Kruskal-Wallis-p-Werte: ∆parA: <0,0001; ∆minD: 0,97; ∆flhG: 1. d Das Löschen von minD oder flhG führte zu einer Fehlpositionierung des Divisoms. Verengungsstellen wurden als „Zellmitte“ betrachtet, wenn sie sich innerhalb von 5 % des Zellzentrums entlang der Längsachse befanden. WT: n = 6; ∆parA, ∆minD und ∆flhG: n = 5 biologisch unabhängige Proben. Brown-Forsythe- und Welch-ANOVA-Test-p-Werte: ∆parA: 0,28; ∆minD: <0,0001; ∆flhG: <0,0001 e Die Löschung von flhG führte im Vergleich zu ΔminD zu einem mittleren Effekt auf die Divisomenpositionierung. Jeder Punkt im Dichtediagramm stellt eine identifizierte Verengungsstelle dar. Hellere Farben stehen für eine höhere Dichte, dunklere Farben für eine geringere Dichte. Die Felder b und e sind in Abb. 3 zusammengefasst. (Alle Bilder) Maßstabsbalken: 2 μm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In ΔflhG-Zellen ähnelten auch die Chromosomenpositionierung (Abb. 4b) und die ParB-Foci-Intensität (Abb. 4c) der von WT, was wiederum darauf hindeutet, dass die Chromosomensegregation nicht beeinflusst wurde. Die Fehlpositionierung der Divisome war jedoch nicht so schwerwiegend wie bei ΔminD-Zellen (Abb. 4d, e), was darauf hindeutet, dass sich anukleate Zellen über einen dritten unterschiedlichen Mechanismus bildeten. Interessanterweise war die Wahrscheinlichkeit, dass ΔflhG-Zellen zwei ParB-Herde aufwiesen, geringer als bei WT-Zellen (Abb. 4a). Stattdessen hatten Zellen vor der Teilung immer noch einen einzelnen ParB-Fokus (Abb. 4b) mit Intensitäten, die auf das Vorhandensein nur einer einzigen Chromosomenkopie schließen ließen (Abb. 4c). Die Zeitraffermikroskopie bestätigte, dass die Positionierung der ParB-Fokus aktiv beibehalten wurde (Zusatzfilm 4). Daher werden kernlose ΔflhG-Zellen wahrscheinlich aufgrund von Defekten in der Chromosomenreplikation und/oder vorzeitiger Zellteilung gebildet; eine Frage zukünftiger Studien.

Zusammengenommen unterstreichen die Ergebnisse, wie wichtig es ist, die funktionellen Beziehungen von A/D-ATPasen untereinander und zum bakteriellen Zellzyklus zu untersuchen, wenn sie im selben Organismus vorkommen.

McdA verwendet das Nukleoid als Positionierungsmatrix für die Verteilung von Carboxysomen27,28. Daher war es überraschend, dass in der ΔparA-Mutantenpopulation alle kernlosen Zellen Carboxysomen behielten (Abb. 5a). Um festzustellen, ob anukleate Zellen de novo synthetisierte Carboxysomen oder Carboxysomen nach der Teilung irgendwie noch vererbt wurden, führten wir eine Zeitraffermikroskopie an ΔparA-Zellen mit fluoreszierenden Carboxysomen durch (Abb. 5b und Zusatzfilm 5A). Interessanterweise erbten kernlose Zellen tatsächlich Carboxysomen, allerdings auf völlig unerwartete Weise. Bei sich teilenden ΔparA-Zellen, denen es nicht gelang, ihre ParB-Herde zu spalten, bündelten sich Carboxysomen in der zu entkernenden Zelle unmittelbar neben der Teilungsebene. Die Carboxysomenbündelung fiel mit der Chromosomenspulenwirkung zusammen, die am invaginierenden Septum unmittelbar vor der vollständigen Teilung und der asymmetrischen Chromosomenvererbung auftrat (siehe ergänzende Abbildung 2g und ergänzender Film 1B). Nachdem die Septierung abgeschlossen war, wurde das massive Carboxysomenbündel explosionsartig vom neuen Pol der kernlosen Zelle freigesetzt, was zu mehreren frei diffundierenden Carboxysomenherden führte (Abb. 5b und Zusatzfilm 5A). Anukleate Zellen, die Carboxysomen enthielten, teilten sich nicht weiter. Wir fanden heraus, dass anukleate Zellen in den Zellpopulationen ΔminD (Abb. 5c und Zusatzfilm 5B) und ΔflhG (Abb. 5d und Zusatzfilm 5C) über denselben Mechanismus auch Carboxysomen erbten. Zusammengenommen zeigen die Daten, wie der Carboxysomenhandel und die Verteilung durch McdA von einer zuverlässigen Chromosomentrennung abhängen. Allerdings können kernlose Zellen immer noch Carboxysomen in parA-, minD- oder flhG-Deletionsstämmen erben, da Carboxysomen von fehlgetrennten Chromosomen abgekratzt werden, die während der Septierung durch die Invaginationsstelle gespult werden. Wir spekulieren, dass alle mesoskaligen Ladungen, die asymmetrisch vererbte Nukleoide als Positionierungsmatrix verwenden, den gleichen Vererbungsmodus aufweisen würden.

a Carboxysomen sind in kernlosen Zellen vorhanden (gestrichelter Kreis). Die gezeigten Mikroaufnahmen sind repräsentative Bilder aus zwei Experimenten. b Zeitraffermikroskopie zeigt, dass Carboxysomen (grün) in ΔparA-Zellen an das Nukleoid gebunden sind, in kernlosen Zellen jedoch über die Freisetzung aus dem extrudierten Chromosom vererbt werden. Carboxysome werden über den gleichen Mechanismus auch in c-ΔminD-Anukleatzellen und d-ΔflhG-Anukleatzellen vererbt. (Alle Videos) Weiße Pfeile markieren die Bündelung und anschließende Freisetzung von Carboxysomen. Maßstabsbalken: 1 μm.

Die A/D-ATPase, die Chemotaxis-Cluster in Rhodobacter sphaeroides positioniert, verwendet das Nukleoid als Positionierungsmatrix41. Daher vermuteten wir, dass A/D-ATPase-Deletionen, die zu kernlosen Zellen führen, indirekt die räumliche Regulierung von Chemotaxis-Clustern in diesen Stämmen beeinflussen würden. Tatsächlich fanden wir heraus, dass parA-, minD- und flhG-Deletionsstämme, die alle kernlose Zellen bilden (siehe Abb. 4a), einen entsprechenden Anstieg bei Zellen ohne Chemotaxis-Cluster aufwiesen (Abb. 6a), und wenn Zellen Herde hatten, war dies der Fall im Vergleich zu WT deutlich schwächer (Abb. 6b).

Das Löschen von parA, minD oder flhG beeinflusst die Chemotaxis-Clusterzahl (WT: n = 4, ∆parA: n = 4, ∆minD: n = 5, ∆mcdA: n = 4, ∆flhG: n = 4, ∆parC : n = 4 biologisch unabhängige Proben. Brown-Forsythe- und Welch-ANOVA-Test p-Werte: ∆parA: 0,0013, ∆minD: 0,0642, ∆mcdA: 0,1141, ∆flhG: 0,0043, ∆parC: 0,0012) und b-Assembly (n = 455 biologisch unabhängige Zellen. Kruskal-Wallis-Test-p-Werte: ∆parA: <0,0001, ∆minD: <0,0001, ∆mcdA: 0,0171, ∆flhG: <0,0001, ∆parC: <0,0001). Nur die Deletion von flhG hatte einen wesentlichen Einfluss auf die c-Anzahl und d-Anordnung der Flagellen (n = 851 biologisch unabhängige Zellen). Kruskal-Wallis-Test-p-Werte: ∆parA: 0,1161, ∆minD: 0,4433, ∆mcdA: 0,0184, ∆flhG: <0,0001, ∆ parC: 0,0051). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Stämme ΔparA und ΔminD zwar mäßige Auswirkungen auf die Bildung von Chemotaxis-Clustern hatten, die Deletion von flhG jedoch schwerwiegender war (Abb. 6a, b). Angesichts der Tatsache, dass Chemotaxis-Cluster mit dem Flagellum kommunizieren, um das Bakterium in Richtung günstiger Bedingungen zu bewegen, nehmen wir an, dass die Anordnung und Organisation von Chemotaxis-Clustern in H. neapolitanus durch die Positionierung des Flagellums reguliert wird. Interessanterweise war dieser Effekt nicht reziprok, da die Löschung von parC nur minimale Auswirkungen auf die Anzahl der Flagellenherde (Abb. 6c) oder die Intensität des Flagellenbasalkörpers (Abb. 6d) hatte. Die Identifizierung der molekularen Akteure, die für dieses Übersprechen bei der räumlichen Regulierung des Flagellum- und Chemotaxis-Clusters verantwortlich sind, ist Gegenstand zukünftiger Arbeiten. Zusammengenommen zeigen unsere Daten wechselseitige Abhängigkeiten darin, wie A/D-ATPasen die Positionierung proteinbasierter Organellen untereinander sowie die Prozesse der DNA-Segregation und Zellteilung koordinieren.

Wir haben experimentell gezeigt, dass mehrere A/D-ATPasen nebeneinander existieren und die Positionierung mehrerer unterschiedlicher Ladungen in derselben Zelle koordinieren. Wir haben auch gezeigt, dass die A/D-basierte Positionierung frachtspezifisch ist. Es wurde gezeigt, dass A/D-ATPasen sehr ähnliche Sandwich-Dimer-Strukturen bilden45,46,47,48, und die Vorhersagen von AlphaFold2 (AF2) legen nahe, dass dies auch für alle fünf hier untersuchten A/D-ATPasen von H. neapolitanus der Fall ist (ergänzende Abbildung). 7a-b). Die strukturellen Ähnlichkeiten legen nahe, dass es konservierte Schnittstellen gibt, die für jede A/D-ATPase einzigartig sind und für Spezifität sorgen, indem sie eine A/D-ATPase mit ihrer jeweiligen Ladung verknüpfen.

Mithilfe von AF2- und Rosetta-Vorhersagen haben wir die A/D-ATPase-Strukturen von H. neapolitanus bestimmt und die mutmaßlichen Interaktionsschnittstellen identifiziert, die jeder Positionierungsreaktion Spezifität verleihen. Es gibt drei Schnittstellen auf einer A/D-ATPase, die Spezifität verleihen: (1) die Dimerisierungsschnittstelle, (2) die Schnittstelle für die Interaktion mit ihrer Positionierungsmatrix (Nukleoid oder Membran) und (3) die Schnittstelle für die Interaktion mit ihrem Partnerprotein , was letztendlich die ATPase mit ihrer Ladung verknüpft. Wir haben diese drei Schnittstellen für alle fünf A/D-ATPasen in H. neapolitanus identifiziert (Abb. 7) und die für diese Assoziationen erforderlichen Schlüsselreste vorhergesagt (Ergänzungsdaten 3).

a Homodimerstrukturen der A/D-ATPasen in H. neapolitanus wurden mit AlphaFold2 (Cyan) generiert. Mutmaßliche Reste für Homodimerspezifität sind magentafarben hervorgehoben. b Dimere von a sind über ihre Positionierungsmatrix – nukleoide DNA oder Membran – ausgerichtet. Mutmaßliche Reste, die für die Bindung von Nukleoid-DNA oder Membran entscheidend sind, sind rot hervorgehoben. c Dimerstrukturen, die an das N-terminal interagierende Peptid mutmaßlicher Partnerproteine ​​(orange) angedockt sind und Ladungsspezifität verleihen. Vergrößerte Box: Die vorhergesagten Reste, die für diese Assoziation entscheidend sind, sind cyanfarbene Leerzeichen auf der ATPase und Orange auf dem Partnerprotein.

Die Spezifität an der Dimerschnittstelle schränkt A/D-ATPasen auf Homodimerisierung ein und ermöglicht dadurch, dass jede A/D-ATPase unabhängig in derselben Zelle ohne Querinterferenz funktioniert (Abb. 7a). Die mutmaßlichen Reste, die für die Homodimerisierung der fünf A/D-ATPasen in H. neapolitanus erforderlich sind, sind in den Ergänzungsdaten 3, Tab. 1 angegeben. 1.

ParA-ähnliche ATPasen nutzen das Nukleoid und MinD-ähnliche ATPasen nutzen die innere Membran zur Ladungspositionierung. ParA, McdA und ParC verfügen an ihren C-Termini über basische Reste für die unspezifische Bindung an Nukleoid-DNA, während MinD und FlhG über Membran-Targeting-Sequenzen (MTSs) für die Membranbindung verfügen (Abb. 7b). Wir haben die vorhergesagten Reste identifiziert, die jede A/D-ATPase benötigt, um sie mit ihrer jeweiligen Positionierungsmatrix zu assoziieren (Ergänzungsdaten 3, Tab. 2).

Die Ladungsspezifität für A/D-ATPasen entsteht durch die Interaktion mit einem Partnerprotein, das entweder mit der Ladung assoziiert oder ein physischer Bestandteil der Ladung selbst ist. Partnerproteine ​​verfügen über einen mit geladenen Resten angereicherten Aminosäureabschnitt am N-Terminus, der ausschließlich mit seiner A/D-ATPase interagiert, während der Rest des Partnerproteins der Ladungsassoziation gewidmet ist49. Wir haben Docking-Modelle jeder A/D-ATPase mit einem N-terminalen Peptid ihres Partnerproteins erstellt (Abb. 7c). Die Peptide wurden als die ersten 30 Reste des mutmaßlichen Partnerproteins vom N-Terminus definiert. Die Peptid-Docking-Simulationen identifizierten mehrere mutmaßliche Reste, die für die Systemspezifität zwischen einer A/D-ATPase und ihrem Partnerprotein von entscheidender Bedeutung sind (Ergänzungsdaten 3, Tab. 3).

Schließlich führten wir in silico eine Alanin-Scanning-Mutagenese über alle Reste durch, die die interagierende Schnittstelle der N-terminalen Peptide von Partnerproteinen umfassen, die an ihre verwandte A/D-ATPase angedockt sind (Ergänzende Daten 3, Tab. 4). Die resultierenden ΔΔG-Werte geben an, inwieweit jeder Rest zur Stabilität der Partnerproteininteraktion mit seiner zugehörigen A/D-ATPase beiträgt. Wichtig ist, dass unsere In-silico-Alanin-Substitutionssimulationen alle Reste identifizierten, von denen experimentell gezeigt wurde, dass sie für das Andocken des MinE-Peptids von Escherichia coli an das MinD-Dimer 47, 50, 51 wichtig sind (ergänzende Abbildung 7c). Zusammengenommen liefern unsere In-silico-Daten einen Fahrplan für die strategische Mutagenese und mechanistische Untersuchung der Spezifitätsdeterminanten, die an der bakteriellen Chromosomensegregation, der Zellteilungspositionierung und dem proteinbasierten Organellenhandel durch A/D-ATPasen über Prokaryoten hinweg beteiligt sind.

Die Untersuchung von A/D-ATPasen konzentrierte sich auf eine bestimmte Ladung eines bestimmten biologischen Prozesses und größtenteils auf Modellorganismen, die nur eine oder zwei A/D-ATPasen kodieren. In diesen Studien werden typischerweise zwei Fragen gestellt: Wie findet eine bestimmte Ladung ihre richtige Position und wie verändert sich diese Position im Laufe der Zeit? Hier lag unser Fokus auf den Positionierungssystemen und nicht auf einem bestimmten Ladungstyp oder biologischen Prozess. Unser systembiologischer Ansatz befasst sich daher damit, wie mehrere A/D-ATPasen die Positionierung verschiedener Ladungen in derselben Zelle koordinieren.

Die Kodierung mehrerer A/D-ATPasen ist eine gemeinsame Funktion aller Prokaryoten. Wir stellen fest, dass über ein Drittel aller sequenzierten Bakteriengenome mehrere A/D-ATPasen kodieren (Abb. 1a), wobei einige Bakterien >10 kodieren. Obwohl die meisten Bakterien die gleichen grundlegenden Ladungen haben, verwenden interessanterweise nicht alle spezielle A/D-basierte Positionierungssysteme. Beispielsweise werden viele der zellulären Frachten, die wir hier gefunden haben, durch A/D-ATPasen in bestimmten Bakterien, wie H. neapolitanus, positioniert, in anderen, wie E. coli, nicht aktiv durch A/D-ATPasen positioniert. Was eine A/D-ATPase benötigt, um eine bestimmte zelluläre Ladung in einem Bakterium und nicht in einem anderen zu positionieren, bleibt eine offene Frage. Es scheint jedoch eine Grenze für die Anzahl der A/D-ATPasen zu geben, die ein Bakterium kodieren kann. A/D-ATPasen sind auch in archaealen Genomen kodiert52, über ihre Rolle in der subzellulären Organisation ist jedoch wenig bekannt. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass archaische Arten in mehreren Phyla, insbesondere Euryarchaeota, mehrere A/D-ATPasen kodieren53. Mehrere dieser Arten enthielten mehr als ein Dutzend, darunter H. volcanii mit 13 A/D-ATPasen, von denen vier MinD-Homologe sind. Bemerkenswerterweise waren nicht alle vier MinD-Homologe für die Zellteilungspositionierung erforderlich, aber eines (MinD4) stimulierte die Bildung von Chemotaxis-Arrays und den Archaella, die das funktionelle Äquivalent des bakteriellen Flagellums sind. Diese Studie betont die Bedeutung der experimentellen Verknüpfung von A/D-ATPasen mit ihren zellulären Ladungen, wie wir es hier getan haben.

Die ParA/MinD-Familie von ATPasen reguliert räumlich und zeitlich eine wachsende Liste verschiedener mesoskaliger Komplexe, die für grundlegende Prozesse in Prokaryoten entscheidend sind, einschließlich Zellwachstum und -teilung, DNA-Segregation, Motilität, Konjugation und Pathogenese20,21. Daher ist das Verständnis, wie A/D-ATPasen die Positionierung zellulärer Frachten am richtigen Ort zur richtigen Zeit koordinieren, der Schlüssel zum Verständnis der Funktion bakterieller Zellen. Unter Verwendung von H. neapolitanus als nicht-pathogenem Modell stützen unsere Ergebnisse nachdrücklich die Idee, dass jede ATPase der Positionierung einer bestimmten zellulären Ladung gewidmet ist. Unser Modell enthüllte auch die Abhängigkeit des proteinbasierten Organellenhandels von der originalgetreuen Replikation und Segregation des Chromosoms sowie der Positionierung der Zellteilung in der Zellmitte. Während die direkte Folge der Löschung von ParA beispielsweise eine Fehlsegregation der Chromosomen war, führte die daraus resultierende asymmetrische Chromosomenvererbung auch zu indirekten Defekten bei der Positionierung von Carboxysomen und Chemotaxis-Clustern. Wir haben auch eine bisher nicht charakterisierte epistatische Beziehung bei der Flagellenpositionierung durch FlhG und deren nachgelagerten Einfluss auf die räumliche Regulierung des Chemotaxis-Clusters durch ParC identifiziert. Es ist bekannt, dass Chemotaxis-Cluster die Zellmotilität steuern, indem sie die Richtung der Flagellenrotation steuern. Allerdings ist unseres Wissens nach ein Übersprechen bei der räumlichen Regulierung von Flagellen- und Chemotaxis-Clustern noch nicht dokumentiert. Zukünftige Studien werden die molekularen Akteure ermitteln, die am Übersprechen zwischen der A/D-basierten Positionierung dieser beiden zellulären Ladungen beteiligt sind, die beide an der Zellmotilität beteiligt sind.

Unsere Bioinformatik identifizierte außerdem eine sechste A/D-ATPase im Genom von H. neapolitanus. Hn1669 ist eine A/D-ATPase, die Homologie zu VirC1 aufweist und sich in der Nähe von trb-Genen befindet, die Komponenten der Konjugationsmaschinerie kodieren (Abb. 1b). Eine einzelne Studie hat gezeigt, dass die VirC1-ATPase, die auf dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens kodiert ist, an der Rekrutierung des konjugativen Ti-Plasmids für die Sekretionsmaschine Typ IV an den Zellpolen beteiligt ist10. Interessanterweise ist in H. neapolitanus das VirC1-Homolog auf einem Integrative Conjugative Element (ICE) kodiert und das stromabwärts gelegene Gen dieser A/D-ATPase kodiert ein ParB-Homolog. ICEs sind wichtige Treiber der bakteriellen Evolution und der Verbreitung von Antibiotikaresistenzgenen54. Wir müssen die Konjugation in H. neapolitanus noch abbilden, aber wir vermuten, dass dieses ParB-Homolog während der Konjugation den ICE-Locus bindet und abgrenzt. Es ist attraktiv zu spekulieren, dass das VirC1-Homolog und sein nachgeschaltetes ParB-Homolog am Transport und der Positionierung des ICE-Locus zur Typ-IV-Sekretionsmaschine am Zellpol zur Konjugation beteiligt sind.

Während A/D-ATPasen Gemeinsamkeiten in Sequenz, Struktur und Biochemie aufweisen, sind die Partnerproteine, die diese ATPasen mit ihren Ladungen verbinden, äußerst vielfältig. Aufgrund dieser Vielfalt konnte das Partnerprotein nicht immer identifiziert werden, weshalb viele A/D-ATPasen als „Waisen“20 bezeichnet werden. Die extreme Diversität ist größtenteils darauf zurückzuführen, dass die Partnerproteine ​​die Spezifitätsdeterminanten bereitstellen, die eine A/D-ATPase mit ihrer zugehörigen Ladung verbinden. Trotz ihrer extremen Vielfalt stützen Daten aus dem gesamten Fachgebiet die Idee, dass Partnerproteine ​​über einen gemeinsamen Mechanismus mit ihren A/D-ATPasen interagieren und diese stimulieren. Es wurde gezeigt oder vermutet, dass Partnerproteine, die an der Plasmidpartition und Chromosomentrennung beteiligt sind, sowie diejenigen, die für die Positionierung von BMCs, Flagellen, Chemotaxis-Clustern und dem Divisom erforderlich sind, über ein positiv geladenes und ungeordnetes N mit ihrer A/D-ATPase interagieren -terminus49. Unsere In-silico-Analyse von A/D-ATPase-Dimeren, die an N-terminale Peptide ihrer Partnerproteine ​​angedockt sind, zeigt, wie spezifische Ladungen zugewiesen werden und wie diese zugehörigen Positionierungssysteme in derselben Zelle ohne gegenseitige Beeinflussung koexistieren und funktionieren.

Zukünftig wollen wir H. neapolitanus als Modell verwenden, um den allgemeinen Transportmodus zu definieren, der von der gesamten A/D-ATPase-Familie gemeinsam genutzt wird, und um zu bestimmen, wie sich Positionierungsreaktionen für unterschiedliche Ladungen verändern. Diese Erkenntnisse sind von Bedeutung, da A/D-ATPasen im Wesentlichen alle Aspekte der Funktion bakterieller Zellen räumlich organisieren. Eine weitere zukünftige Richtung besteht darin, die hier identifizierten Spezifitätsdeterminanten für jedes Partnerprotein und jede Partnerladung experimentell zu verifizieren und dieses Wissen für die rationale Gestaltung von Positionierungssystemen in Bakterien zu nutzen. Es wird erwartet, dass diese Beiträge von Bedeutung sind, da minimale selbstorganisierende Systeme wichtige Werkzeuge für die synthetische Biologie sind55. Unser Ziel ist es, minimale autonome Positionierungssysteme (MAPS) zu entwerfen, die aus einer Positionierungs-ATPase und ihrem N-terminalen Partnerprotein-Peptid als „Gepäckanhänger“ bestehen und als räumliche Regulatoren für natürliche und synthetische Ladungen in heterologen Bakterien verwendet werden sollen.

Die tBLASTn-Analyse wurde unter Verwendung einer ParA/MinD-Konsensussequenz (xKGGxxK[T/S]) als Abfrage für die RefSeq-Repräsentantengenomdatenbank mit maximalen Zielsequenzen von 5000 und einem E-Wert-Schwellenwert von 0,0001 durchgeführt. Die Sequenzen wurden nach solchen gefiltert, die eine gemeinsame Sequenzhomologie aufwiesen und eines der identifizierten mutmaßlichen Frachtgene aufwiesen, was mithilfe von webFlaGs bestätigt wurde (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32956448/). Die Konsensabfrage wurde mit COBOLT (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17332019/) generiert.

Einige repräsentative Genome wurden ausgewählt, um die Erhaltung der Gennachbarschaft zu zeigen. Die Identifizierung der Replikationsursprünge (OriCs) wurde mit Ori-Finder (https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-9-79) durchgeführt. Die FlaGs-Analysefigur wurde mit Gene Graphics (https://katlabs.cc/genegraphics/) erstellt.

Die Sequenzen wurden mit Clustal Omega ausgerichtet. Der resultierende Baum wurde in iTOL importiert, um einen nicht verwurzelten Baum zu erzeugen. (NCBI-Zugangsnummern: Hn2335 – ACX97145.1; Hn1364 – ACX96198.1; Hn0912 – ACX95755.1; Hn0716 – ACX95565.1; Hn0722 – ACX95571.1; Hn1669 – ACX96495.1; Hn0255 – ACX9511 8.1).

Alle in dieser Studie beschriebenen Mutanten wurden unter Verwendung von WT Halothiobacillus neapolitanus (Parker) Kelly and Wood (ATCC® 23641™) konstruiert, das von ATCC erworben wurde. Die Kulturen wurden in ATCC® Medium 290: S-6-Medium für Thiobazillen (Hutchinson et al., 1965) gezüchtet und bei 30 °C unter Schütteln bei 130 U/min in Luft, ergänzt mit 5 % CO2, inkubiert. Die Stämme wurden bei –80 °C in 10 % DMSO eingefroren aufbewahrt.

Alle Konstrukte wurden mit Gibson Assembly generiert und durch Sequenzierung verifiziert. Fragmente für den Zusammenbau wurden durch PCR synthetisiert oder als gBlock (IDT) bestellt. Die Konstrukte enthielten flankierende DNA mit einer Länge von 750 bis 1100 bp stromaufwärts und stromabwärts der Zielinsertionsstelle, um die homologe Rekombination in die genomischen Zielorte zu fördern. Die Klonierung von Plasmiden wurde in chemisch kompetenten E. coli Top10- oder Stellar-Zellen (Takara Bio) durchgeführt.

Kompetente Zellen von H. neapolitanus wurden wie zuvor berichtet erzeugt. Kurz gesagt, 1 l Kultur wurde auf eine OD von 0,1–0,15 gezüchtet. Die Kulturen wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 5000 x g und 4 °C geerntet. Die Pellets wurden resuspendiert und zweimal mit 0,5 Volumina eiskaltem Nanoporenwasser gewaschen. Alle Waschzentrifugationsschritte wurden 30 Minuten lang bei 3000 x g und 4 °C durchgeführt. Das resultierende Pellet wurde nach dem Waschen in 1 × 10−3 Volumina eiskaltem Nanoporenwasser resuspendiert. Diese kompetenten Zellen wurden sofort verwendet oder zur späteren Verwendung bei –80 °C eingefroren. Gefrorene kompetente Zellen wurden vor der Verwendung bei 4 °C aufgetaut.

50–100 µL kompetente Zellen wurden mit 5 µL Plasmid-DNA (1–5 µg) gemischt und 5 Minuten auf Eis inkubiert. Diese Mischung wurde dann in ein Röhrchen mit 5 ml eiskaltem S6-Medium ohne Antibiotika überführt und 5 Minuten auf Eis inkubiert. Die Transformationen wurden 16–36 Stunden lang unter Schütteln mit 130 U/min, bei 30 °C und in mit 5 % CO2 angereicherter Luft wiederhergestellt. Die Klone wurden durch Ausplattieren auf selektivem Medium mit Antibiotika selektiert. Kolonien wurden neu gestreift. Nachgestrichene Kolonien wurden durch PCR auf Mutation überprüft.

Für die native fluoreszierende Fusion von ParB-mNG, mNG-FliN und CheY-mNG wurde die Sequenz, die das fluoreszierende Protein mNeonGreen (mNG) kodiert, an die 3'- oder 5'-Region der nativen kodierenden Sequenzen angehängt, getrennt durch einen GSGSGS-Linker . Für die native fluoreszierende Fusion von Cbbs-mTQ wurde die Sequenz, die das fluoreszierende Protein mTurquoise (mTQ) kodiert, an die 3'-Region der nativen kodierenden Sequenz angehängt, getrennt durch einen GSGSGS-Linker. Eine Kanamycin-Resistenzkassette wurde vor dem Gen für N-terminale Tags oder nach dem Gen für C-terminale Tags eingefügt. Bei Bedarf wurde der Promotor dupliziert. Der Mutant wurde durch Ausplattieren auf S6-Agarplatten, ergänzt mit 50 μg/ml Kanamycin, selektiert. Alle Fusionen wurden durch PCR verifiziert.

Bei Deletionen von Hn2335, Hn1364, Hn0912 und Hn0722 wurden die Gene durch eine Spectinomycin-Resistenzkassette ersetzt, gefolgt von einem duplizierten Promotor für das Downstream-Gen. Die Deletion von Hn0716 wurde durch Codon-Optimierung des Downstream-Gens und Einfügen der Spectinomycin-Resistenzkassette nach diesem Codon-optimierten Gen erreicht. Mutanten wurden durch Ausplattieren auf S6-Agarplatten, ergänzt mit 50 μg/ml Spectinomycin, ausgewählt. Alle Mutationen wurden durch PCR verifiziert.

Die gelöschten Gene (Hn2335, Hn1364, Hn0912, Hn0716 und Hn0722) wurden einzeln unter die Expression eines Ptrc-Promotors gestellt und an einer neutralen Stelle zwischen den Genen Hn0933 und Hn0934 eingefügt. Mutanten wurden durch Ausplattieren auf S6-Agarplatten, ergänzt mit 25 µg/ml Chloramphenicol, ausgewählt. Die Insertion wurde durch PCR verifiziert. Für die Bildgebung wurden Zellen bis zu einer OD von 0,1 gezüchtet, mit 0, 0,25, 1, 5, 10 und/oder 50 µM IPTG für bis zu 6 Stunden induziert und zu verschiedenen Zeitpunkten auf Komplementierung abgebildet. Hn2335 ergänzt mit 50 µM IPTG für 3 Stunden. Hn1364, ergänzt mit 50 µM IPTG für 6 Stunden. Hn0716, ergänzt durch eine Leaky-Expression des Ptrc-Promotors, und eine Induktion war nicht erforderlich. Hn0912 und Hn0722 ergänzten sich nicht mit diesen Genen allein. Für diese beiden Mutanten wurden zusätzliche Konstrukte erstellt, um die benachbarten überlappenden Gene einzubeziehen: Hn0911-Hn0912 und Hn0722-Hn0723. Konstrukte wurden wie oben beschrieben generiert, verifiziert, induziert und abgebildet. Hn0911-Hn0912 ergänzt mit 50 µM IPTG für 3 Stunden. Hn0722-Hn0723 ergänzt mit 50 µM IPTG für 3 Stunden.

Die gesamte Lebendzellmikroskopie wurde mit exponentiell wachsenden Zellen durchgeführt. 3–5 µL Zellen wurden auf ein Stück 2 % UltraPure-Agarose (Invitrogen, Katalognummer 16500) + S6-Pad getropft und auf einer 35-mm-Glasbodenschale (MatTek, Katalognummer P35G-1.5-14-C) abgebildet. . Die gesamte Fluoreszenz- und Phasenkontrastbildgebung wurde mit einem motorisierten Umkehrmikroskop Nikon Ti2-E durchgeführt, das von der NIS Elements-Software mit einer SOLA 365 LED-Lichtquelle, einem 100X-Objektiv (Oil CFI Plan Apochromat DM Lambda Series für Phasenkontrast) und einem Photometrics gesteuert wurde Prime 95B rückseitig beleuchtete sCMOS-Kamera oder eine Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT + sCMOS-Kamera. ParB-mNG, mNG-FliN und CheY-mNG wurden mit einem „GFP“-Filtersatz (C-FL GFP, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation: 470/40 nm [450–490) abgebildet nm], Emission: 525/50 nm [500-550 nm], dichroitischer Spiegel: 495 nm). CbbS-mTQ-markierte Carboxysomen wurden mit einem „CFP“-Filtersatz abgebildet (C-FL CFP, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation: 436/20 nm [426-446 nm], Emission: 480/ 40 nm [460–500 nm], Dichroitischer Spiegel: 455 nm). Die DAPI-Fluoreszenz wurde mit einem standardmäßigen „DAPI“-Filtersatz (C-FL DAPI, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Anregung: 350/50 nm [325–375 nm], Emission: 460/50 nm) abgebildet [435-485 nm], dichroitischer Spiegel: 400 nm). Alexa Fluor 594 C5 Maleimid-konjugierte Flagellen wurden mit einem „TexasRed“-Filtersatz (C-FL Texas Red, Hard Coat, High Signal-to-Noise, Zero Shift, Excitation: 560/40 nm [540–580 nm]) abgebildet. Emission: 630/75 nm [593–668 nm], dichroitischer Spiegel: 585 nm).

Für die Mehrgenerationen-Zeitraffermikroskopie wurden 1,5 % UltraPure-Agarose (Invitrogen, Katalognummer 16500) + S6-Pads in 35-mm-Glasbodenschalen (MatTek, Katalognummer P35G-1.5-14-C) gegossen. Die Schalen wurden mindestens 24 Stunden lang bei 30 °C in 5 % CO2 vorinkubiert. 4 µl exponentiell wachsender Zellen wurden auf das Agar-Pad getüpfelt. Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO2-Konzentration wurden mit einem Tokai Hit Inkubationssystem kontrolliert. Für die Bildaufnahme wurde die Software NIS Elements verwendet. Die Zellen wurden vor der Bildaufnahme mindestens 30 Minuten lang auf der Tischplatte vorinkubiert. Die Videos wurden mit einem Bild alle 2,5–5 Minuten über eine Dauer von 12–24 Stunden aufgenommen.

Für jeden Mutanten wurden mehrere Sichtfelder erfasst. Alle Fluoreszenzkanäle wurden auf Fidschi einer Hintergrundsubtraktion mit einem Rollkugelradius von 50 μm unterzogen. Hintergrundsubtrahierte Fluoreszenzbilder wurden mit Phasenkontrastbildern zusammengeführt, um Kompositbilder für die Bildanalyse zu erstellen. Die Bildanalyse einschließlich Zellidentifizierung, Quantifizierung der Zelllänge, Fokuslokalisierung, Fokusanzahl, Fokusfluoreszenzintensität und Identifizierung von Verengungsstellen wurde mit dem Fiji-Plugin MicrobeJ 5.13I56,57 durchgeführt. Die Erkennung und Segmentierung des Zellumfangs erfolgte mithilfe des stabförmigen Deskriptors mit standardmäßigen Schwellenwerteinstellungen bei einer Toleranz von 56. Maxima-Erkennungsparameter wurden für jede Ladung individuell festgelegt. Für die Erkennung von ParB-mNG-Herden (Fracht = Chromosom) wurden Toleranz und Z-Score jeweils auf 100 festgelegt. Für die Erkennung von Herden von CheY-mNG (Fracht = Chemotaxis) wurde die Toleranz auf 150 und der Z-Score auf 100 festgelegt mNG-FliN (Fracht = Flagellen)-Herdeerkennung, die Toleranz wurde auf 710 und der Z-Score auf 69 eingestellt. Für die CbbS-mTQ (Fracht = Carboxysom)-Herdeerkennung wurde die Punkterkennung anstelle der Herderkennung verwendet und die Toleranz wurde eingestellt bis 1010. Die Ergebnisse wurden manuell mit dem Experimenteditor überprüft und nicht segmentierte Zellen wurden mit einem Partikelschneider geschnitten. Für jeden Stamm wurden Assoziationen, Formbeschreibungen, Profile und Lokalisierung aufgezeichnet. Lokalisierungsdiagramme wurden automatisch durch MicrobeJ generiert. Fluoreszenzintensitätsdiagramme und Diagramme zur Anzahl der Brennpunkte wurden in GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, www.graphpad.com) erstellt.

Die Zellen wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 5000 g geerntet. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in PBS, pH 7,4, gewaschen. Das resultierende Zellpellet wurde in 100 μl PBS resuspendiert und mit SytoxBlue (Invitrogen, Katalognummer S34862) bei einer Endkonzentration von 500 nM angefärbt. Die Proben wurden im Dunkeln bei Raumtemperatur 5–10 Minuten lang inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden direkt auf ein S6-Agar-Pad geladen, das mit 500 nM SytoxBlue infundiert worden war.

Innerhalb von 2 Minuten wurden elf Bilder aufgenommen. Carboxysome wurden in jedem Frame gezählt. Für die Carboxysomenzählung wurde die höchste pro Zelle gezählte Zahl verwendet.

Motilitätstests wurden in S6 in 0,4 % Agar durchgeführt. Die Zellen wurden auf einer Platte mit S6-Medium gezüchtet. Einzelne Kolonien wurden in Röhrchen oder Platten mit Motilitätsmedium inokuliert und bei 30 °C in Luft, ergänzt mit 5 % CO2, inkubiert. Röhrchen und Platten wurden 2 Wochen lang täglich auf Beweglichkeit überprüft.

H. neapolitanus Flagellin wurde mithilfe einer BLAST-Homologiesuche mit Hag aus Bacillus subtilis als Abfrage identifiziert. Es wurde nur ein einziges Flagellin-Gen gefunden. Für die Cysteinmutagenese wurden mehrere Threonin- und Serinreste in Betracht gezogen. Rückstände wurden mit dem Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB, E0554S) mutiert. Klone wurden durch Sequenzierung auf Cysteinmutation überprüft.

Der Maleimidfarbstoff Alexa Fluor 594 C5 (Invitrogen, A10256) wurde in DMSO auf die Arbeitskonzentration von 10 mM resuspendiert. H. neapolitanus-Kulturen wurden bis zu einer OD von 0,1–0,2 gezüchtet. Die Kulturen wurden mit PBS, pH 11,7, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Zellen mit einem eingestellten pH-Wert von 7,0 wurden dann mit dem Maleimidfarbstoff Alexa Fluor 594 C5 bei einer endgültigen Farbstoffkonzentration von 100 µM gefärbt. Färbekulturen wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden mehr als viermal in PBS, pH 7,4, gewaschen. Alle Zentrifugationsschritte wurden 3 Minuten lang bei 5000 × g durchgeführt.

Für Gesamtpopulationsanalysen, wie Fluoreszenzintensitäts- und Zelllängenmessungen, führten wir einen nichtparametrischen Wilcoxon-Test (Kruskal-Wallis) durch, gefolgt von einem Dunn-Mehrfachvergleichstest. Für Analysen des Prozentsatzes der Population, wie z. B. die Anzahl der Herde oder das Vorhandensein von Verengungsstellen in der Zellmitte, wurden die Populationen als separate Sichtfelder analysiert und die zusammenfassenden Werte wurden als separate Datenpunkte aufgezeichnet. Anschließend führten wir einen Brown-Forsythe- und Welch-ANOVA-Test durch, gefolgt von Dunnetts T3-Mehrfachvergleichstest. Zur Durchführung aller Analysen wurde GraphPad Prism (Version 9.5.1) verwendet. P-Wert-Stil: 0,1234 (ns), 0,0332 (*), 0,0021 (**), 0,0002 (***), < 0,0001 (****).

Filme wurden mit Fidschi zugeschnitten. Filme wurden mit dem Mehrkanal-Hyperstack-Alignment-Plug-in namens HyperStackReg stabilisiert. Zeitstempel- und Maßstabsbalkenanmerkungen wurden mithilfe von Fiji hinzugefügt. Pfeile und Pausen wurden mit Adobe Premier Pro hinzugefügt.

Für MinD und McdA haben wir die N-Terminus-Peptid-ATPase-Docking-Modelle mithilfe der CollabFold-Implementierung von AlphaFold258,59 generiert. Die N-terminalen Peptide wurden als die ersten 30 Reste des mutmaßlichen Partnerproteins vom N-Terminus definiert. Mit MMseqs2 wurden mehrere Sequenz-Alignments erstellt. Für jedes Peptid-ATPase-Paar haben wir fünf Strukturen generiert, wobei die standardmäßigen CollabFold/AlphaFold2-Hyperparameter gespeichert wurden, damit die Anzahl der Zyklen für jedes Modell auf 12 erhöht wurde. Als Standard für Alphafold2 wurden die Strukturen mit AMBER unter Verwendung des Amber99sb-Kraftfelds energetisch minimiert. Wir haben angedockte Peptidmodelle basierend auf den pLDDT-Scores der Bindungsschnittstellenreste und der Ähnlichkeit mit zuvor aufgelösten ParA-ähnlichen ATPase/Partnerprotein-Kristallstrukturen ausgewählt.

Für ParA, FlhG und ParC haben wir angedockte Peptidmodelle mit dem FlexPepDock-Protokoll von Rosetta60 generiert. Zuerst haben wir die aus AlphaFold2 generierten ATPase-Homodimerstrukturen mit dem FastRelax-Vollatom-Verfeinerungsprotokoll mit kartesischer Koordinatenraumminimierung unter Verwendung des lbfgs_armijo_nonmonotone-Minimierers auf das Rosetta-Kraftfeld ref2015_cart_cst ins Gleichgewicht gebracht. Um die von AlphaFold2 vorhergesagte Position der Rückgratatome beizubehalten, wurde eine Rückgratatomkoordinatenbeschränkung hinzugefügt. Für diesen ersten Schritt haben wir 20 Trajektorien generiert, wobei die Struktur mit der niedrigsten Bewertung für den Peptid-Docking-Schritt verwendet wurde. Wir haben den Score3 mit den Kraftfeldern docking_cen.wts_patch und REF2015 für die Docking-Schritte mit niedriger bzw. hoher Auflösung des FlexPepDock-Protokolls verwendet. Für jedes mutmaßliche Partnerprotein/ATPase-Paar haben wir 50.000 Andocktrajektorien simuliert. Die oberen zweitausend Flugbahnen, die durch die niedrigste Energie definiert wurden, wurden dann mit Calibur61 geclustert. Anschließend wählten wir die endgültigen Modelle basierend auf Clusterinformationen, Energetik und mechanistischer Plausibilität aus. Aus den endgültigen angedockten Modellen, die aus den Rosetta- und Alphafold2-Simulationen ausgewählt wurden, versuchten wir, wichtige Bindungsreste durch einen In-silico-Alanin-Mutationsscan und ΔΔG-Berechnungen zu identifizieren. Wir haben alle Schnittstellenreste des angedockten Peptids iterativ mutiert und das ΔΔG mithilfe des FlexDDG-Protokolls in Rosetta mit dem Kraftfeld talaris201462 berechnet. In FlexDDG wurden für jede Mutation die Rückgrat- und Seitenkettenkonformationen 35.000 Mal mithilfe der Monte-Carlo-Backrub-Methode von Rosetta abgetastet. In jedem 2500-Proben-Intervall wurde das ΔΔG der Mutation berechnet. Das endgültige gemeldete ΔΔG ist der Durchschnitt von 35 solchen Trajektorien.

(NCBI-Zugangsnummern: ParA-Partnerprotein (ParB) – ACX97144.1; MinD-Partnerprotein (MinE) – ACX96199.1; McdA-Partnerprotein (McdB) – ACX95754.1; FlhG-Partnerprotein (FliA) – ACX95566.1; ParC Partnerprotein (CheW) – ACX95572.1). Die ersten 30 Aminosäuren vom N-Terminus jedes Partnerproteins wurden in silico mit AlphaFold2 (MinD, McdA) oder Rosetta (ParA, FlhG, ParC) an die Dimerstrukturen angedockt. Die Bindungsschnittstelle wurde durch diejenigen Reste definiert, die mindestens 1 Angström2 gemeinsame Oberfläche hatten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Bakteriengenome, erhalten aus der NCBI RefSeq DataBase (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). Experimentell bestimmte ParA/MinD-ATPase-Strukturen aus der Proteindatenbank (PDB): ParA (5U1G); McdA (6NOP); ParC (5U1G); MinD (3Q9L); FlhG (4RZ3). Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. In diesem Dokument werden auch Quelldaten bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. In diesem Dokument werden auch Quelldaten bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der während dieser Studie generierte Code ist auf GitHub verfügbar: Identifying ParA/MinD ATPases in Bacteria using BLAST (https://github.com/krthkkrv/Multiple-ParA-MinD-ATPases-coordinate-the-positioning-of-disparate-cargos -in-einer-bakteriellen-Zelle)63, Identifizierung der Spezifitätsdeterminanten jeder ParA/MinD-ATPase in H. neapolitanus unter Verwendung von AlphaFold2 und Rosetta (https://github.com/jilimcaoco/Multiple-ParA-MinD-ATPases)64.

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Pulianmackal, LT et al. Mehrere ParA/MinD-ATPasen koordinieren die Positionierung unterschiedlicher Ladungen in einer Bakterienzelle. GitHub https://doi.org/10.5281/zenodo.7941697 (2023).

Pulianmackal, LT et al. Mehrere ParA/MinD-ATPasen koordinieren die Positionierung unterschiedlicher Ladungen in einer Bakterienzelle. GitHub https://doi.org/10.5281/zenodo.7941403 (2023).

Referenzen herunterladen

Wir danken Joshua S. MacCready, Christopher A. Azaldegui, Joseph L. Basalla, Ajai J. Pulianmackal und Claudia Mak für ihre nachdenklichen Diskussionen. Wir danken Holly Turula und Miles Mckenna für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation Award Nr. 1817478 (AGV), das Graduate Research Fellowship Program DGE 1841052 (LTP) der National Science Foundation und aus Forschungsinitiierungsmitteln der MCDB-Abteilung (AGV) unterstützt.

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, USA

Lisa T. Pulianmackal

Abteilung für Computermedizin und Bioinformatik, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, USA

Jose Miguel I. Limcaoco und Matthew J. O'Meara

Abteilung für Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, USA

Keerthikka Ravi, Sinyu Yang, Jeffrey Zhang, Mimi K. Tran, Maria Ghalmi und Anthony G. Vecchiarelli

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Konzeptualisierung, LTP und AGV; Methodik, LTP, MJL, KR; Formale Analyse, LTPMJL, KR, SY, MG, MJO und AGV; Untersuchung, LTP, JZ und MKT; Ressourcen, AGV; Schreiben – Originalentwurf, LTP und AGV; Visualisierung, LTP, JMIL, KR und AGV; Aufsicht, LTP, MJO und AGV; Finanzierungsakquise, LTP und AGV

Korrespondenz mit Anthony G. Vecchiarelli.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Kai Thormann und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Pulianmackal, LT, Limcaoco, JMI, Ravi, K. et al. Mehrere ParA/MinD-ATPasen koordinieren die Positionierung unterschiedlicher Ladungen in einer Bakterienzelle. Nat Commun 14, 3255 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39019-x

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Eingegangen: 12. Januar 2023

Angenommen: 22. Mai 2023

Veröffentlicht: 05. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39019-x

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